En el 2004, Leon fue asignado al Servicio Secreto de los Estados Unidos. Su primera misión es salvar a la hija del Presidente, Ashley Graham, que desapareció. La información obtenida apunta a que los secuestradores se encuentran en un área remota de España. Leon investiga por su cuenta, junto con dos miembros de la policía nacional de España. Desafortunadamente, algo grotesco parece que le ha ocurrido a la gente del pueblo y después de que los dos agentes sean prontamente asesinados, Leon se encuentra confiando de nuevo en sus habilidades en una mortal lucha por la supervivencia.
Leon aprende por sus superiores que los perpetradores son un grupo llamado "Los Iluminados", un culto religioso liderado por un hombre llamado Osmund Saddler. Este culto utiliza unos misteriosos organismos parasitarios conocidos como "Las Plagas" para controlar a los pueblerinos locales, así como otros en los alrededores, como un grupo de Mercenarios. Aunque parece una situación sin esperanzas, el culto fanático encuentra a Leon un rival más formidable de lo que pensaban, frustrando cada uno de los planes para acabar con él.
Durante su misión le ayuda Luis Sera, un hombre que es un investigador que trabajaba para Saddler, pero le traicionó. Leon además se encuentra con Ada Wong, una antigua conocida en el accidente de Racoon City. Aunque no se notara demasiado Leon está enamorado de Ada desde que la conoció en Racoon City y viceversa. Ada proporciona ayuda a Leon durante su aventura.
Leon encuentra a Ashley en una iglesia y se vuelve responsable de su seguridad mientras avanzan por el área controlada por Los Iluminados. Es revelado, además, que Leon y Ashley han sido infectados por las Plagas y están ahora en una carrera contra el tiempo para encontrar una cura antes de convertirse en los esclavos de Saddler.
Adquiriendo armas de un misterioso mercader (conocido como el Buhonero), Leon se las arregla para pasar a través de estremecedores peligros dentro del pueblo local y un misterioso castillo dirigido por el culto. Leon lucha contra dos de los subordinados de Saddler: el alcalde del pueblo, Bitores Méndez y Ramón Salazar, el castellano. En el castillo, Luis es asesinado por Saddler. Leon se enfrenta además a su antiguo camarada, Jack Krauser, quien está trabajando como doble agente para un grupo misterioso y para Saddler. Al jugador le es revelado (pero no a Leon) que el líder de ese grupo no es otro que Albert Wesker, para quien está trabajando Ada.
Con el desconocimiento de Leon, una batalla secreta está ocurriendo detrás de las escenas, que son exploradas en el modo de juego desbloqueable, "Separate Ways", en el que se narra la aventura desde el punto de vista de Ada. Eventualmente, Ashley es raptada y Leon debe correr contra el tiempo para rescatarla antes de que su Plaga se desarrolle completamente, por no mencionar la suya. Con el continuo soporte de Ada, Leon lucha a través de una base militar local, donde Saddler y el culto han tomado refugio. Leon lucha contra Krauser por última vez y finalmente salva a Ashley y a él mismo eliminando Las Plagas de su interior usando una máquina que emite radiaciones especiales, desarrollada por Luis durante su misión.
Después, Leon lucha contra Saddler en su verdadera forma y, con la ayuda de Ada (quien le proporciona ayuda con un lanzacohetes especial), es capaz de acabar con él y su complot.
Tras la batalla, Ada le roba la muestra de la Plaga que Leon tomó de los restos de Saddler y escapa en helicóptero, aunque le da a Leon las llaves de su moto acuática para que escapen, ya que la isla va a estallar. Tras completar su misión, Leon habla con Hunnigan con la que finalmente logra reestablecer contacto
En el 2005, Leon ha evolucionado mucho desde su primera aparición como policía novato en Raccoon City. De hecho, en esta película podemos ver un Leon con un aspecto aun más serio y maduro que en Resident Evil 4, juego que transcurría un año antes.Wilpharma, teniendo sus propios miembros que trabajan en distintos bandos, extiende el Virus-T en una terminal del aeropuerto de Harvardville. El edificio es cerrado por el gobierno mientras mandan a los marinos y el Equipo Especial de Respuesta (Special Responce Team) para deshacerse de los zombies. Leon es enviado por la Casa Blanca para tomar cartas en el asunto debido a su experiencia en estos casos. Bajo su liderazgo él logra rescatar no nada mas a Claire Redfield, sino que también rescata al Senador Davis y otros sobrevivientes.
Tratando de aclarar las dudas, Leon es informado sobre la nueva vacuna para el Virus-T y mas tarde explica que Wilpharma no tenia nada que ver con el reciente incidente en la terminal, TerraSave, la organización en la que Claire trabajaba y que estaba en contra de los eventos bio-terroristas, había presionado tanto que había tergiversado todo. Al parecer, Wilpharma no estaba involucrado en los incidentes de los cuales se le acusaba, sino que los terroristas habían tomado posesión del Virus-T para esparcirlo y amenazar.
Tras ver que uno de los responsables por el brote, Curtis Miller, era el hermano de Angela Miller, una mujer miembro del Equipo Especial de Respuesta (Special Responce Team) decide acompañarla para aclarar todo el asunto. Al llegar a la casa de Curtis,Angela y Leon descubren que él ha escapado y ha quemado su propia casa. Minutos mas tarde Claire lo llama por celular para informarle sobre el Virus-G que tienen escondido en las instalaciones de Wilpharma y pronto se pierde la comunicación. Tanto Angela como Leon deciden ir a rescatarla y averiguar mas sobre lo que sucedía. Al llegar al lugar ellos se separan. Eventualmente Claire y Leon se reúnen de nuevo y ella le informa que Curtis Miller estaba ahí y había destruido parte de las instalaciones, Leon la ayuda a buscar una salida mientras se propone a buscar a Angela y a Curtis. Curtis se infecta del Virus-G y muta, Leon lucha por proteger a Angela y destruir a Curtis, quien con el paso del tiempo vuelve a mutar tal y como William Birkin lo había hecho en Raccoon City.
En un intento por escapar de sus garras ambos se sumergen en lo que parece ser un tanque de agua, Leon le aplica respiración boca a boca a Ángela para que ésta no se quede sin aire y salen de ahí, no obstante Curtis también sobrevive y trata de llevarse a Angela debido a su conexión sanguínea. A pesar de que él logra reaccionar tras ver una fotografía de su familia y hermana, Leon advierte que ya no es Curtis como tal y logra destruirlo. Al final Wilpharma queda en bancarrota y tanto Leon como Claire y Angela logran sobrevivir.
Claire empieza a deducir todo echándole la culpa al Senador quien aparentemente había ordenado mantener el Virus-G en las instalaciones y en secreto, mas tarde Leon asegura que el Senador había sido un peón en todo tal y como Curtis lo fue. El verdadero villano era Frederic Downing, un investigador y empleado de Wilpharma quien había estado involucrado en el desarrollo de la vacuna y que además trabajaba en secreto con el General El Grande, el terrorista implicado en todos aquellos incidentes. Frederic es descubierto y, tanto Claire como Leon y Angela, logran atraparlo. Al final confiesa sus planes y Wilpharma esta oficialmente en bancarrota. Tricell es la nueva compañía que compra a Wilpharma y que se hace cargo de la investigación. Al final de la película se ve a el personal de esta compañía dentro de las instalaciones de Wilpharma para buscar pistas y recuperar de alguna forma los restos del Virus-G.Unos años mas tarde, el presidente abandona la Casa Blanca, donde Leon se queda en la calle, hasta que Claire lo contacta para ser, junto con Chris, miembro de la recien formada BSAA.
